mutagenesis-40

pymol怎么标二硫键

突变氨基酸残基

如把4hbk 中的arg-40 突变成 lys-40,。

在菜单中点击 wizard->mutagenesis->protein。

参考

pymol如何突变氨基酸残基

巯基的检测方法

【软件使⽤】PyMol⼊门教程。

主要讲述PyMOL中常见的图形界⾯（⿏标）操作。

1.认识PyMol

1. 软件界⾯介绍

image.png

1.2 内置demo介绍

打开PyMOL，点击1.1菜单窗⼝的Wizard菜单，然后点击Demo->Representations 然后在2.3 对象窗⼝ 和 2.4模式窗⼝之间会出现各种⽰例：

1.Representations。

2.Cartoon Ribbons。

3.Roving Detail。

4.Roving Density。

5.Transparency

6.Ray Tracing

7.Sculpting

8.Scripted Animation。

9.Electrostatics。

10.CGOs

11.Molscript/R3D Input。

12.End Demonstration 关闭⽰例。

image.png

Fig5.png Fig6.png。

File->Reinitialize->Everything 注意的是该操作会删除当前所有的Object.。

2.2 Action

第⼀部分： 常⽤显⽰操作

点击 A->preset->simple 显⽰蛋⽩的简单形式。

点击 A->preset->ball and stick 显⽰球棍模型。

点击 A->preset->b-factor putty 基于bfactor数值显⽰蛋⽩的柔性。

点击 A->preset->publication ⾼质量出版标准。

第⼆部分 对象的操作

删除⽔分⼦ A->remove waters。

该操作属于红⾊警告操作，不可逆操作。删除⽔分⼦后，⽆法通过Ctrl-Z进⾏撤销。

增加删除氢原⼦

在line和stick 模式下⾯可以看到H原⼦，cartoon模式下⾯看不到氢原⼦，因此在line或者stick模式下，执⾏下述操作。

A->Hydrogens->remove 删除所有氢原⼦。

A->Hydrogens->add 增加所有氢原⼦。

A->Hydrogens->remove non polar 删除所有⾮极性氢原⼦，我们可以看到C上的氢原⼦全部被删除。

A->Hydrogens->remove 再次删除所有氢原⼦。

A->Hydrogens->add polar 增加极性氢原⼦。

第三部分 对象的复制 剪切 删除 重命名。

复制 A->Copy to object->new。

我们会得到⼀个名为new的object，为了和4hbk object 进⾏区分。

对4hbk 的obect 点击C->cyan 和S->AS ->cartoon。

对obj01 点击 C->green 和S->as->stick。

重命名 obj01-> 4hbk_02。

对obj01 点击A->rename object。

删除 A->delete object。

如果要删除当前所有的object的话，可以在1.3命令输⼊窗⼝输⼊delete all。

剪切 适合选中的对象 A->Extract。

我们可以通过剪切的操作把配体和蛋⽩分开，⾸先选中配体，然后点击A->extract object 就可以了， 原来结构中的配体就跑到obj01中了，这样就分开了蛋⽩和配体。下⾯会有具体的例⼦来说明。

image.png

image.png

应⽤: 选择蛋⽩的特定残基

我们通过软件 D3Pockets 可以确定4hbk中⼝袋中氨基酸残基的组成：

ILE15-TRP20, TYR39, ASP43-ALA45, VAL47, TYR48, LYS77, TRP79, ASN80,。

LEU108, HIS110, TRP111, LEU115, PHE122, LEU130, SER159, ASN160, GLN181, GLU183, HIS185, 185 207 208 209。

210 211 222 223 240 241 243 244。

255 256 257 258 263 264 266 267。

270 292 293 294 295 298 306。

我们点击Sequence，并将Selecting模式切换为residues，然后基于残基编号进⾏选择。

把上述残基选中以后会临时保存在sele的object中，我们把它复制到obj01的Object中，并重名为Pocket，然后对Pocket的Object，显⽰其表⾯，结果如图所⽰。

image.png

2.5 蛋⽩对象的着⾊操作

pymol中内置了多种不同的着⾊⽅案，如图所⽰：

按照原⼦类型着⾊

点击object上的 C按钮 -> by element。

按照⼆级结构着⾊

按照b-factor着⾊

按照整体着⾊

设置背景颜⾊

背景颜⾊默认是⿊⾊的，发表⽂章的时候背景颜⾊通常设置为⽩⾊。 |。

点击菜单栏中的 Display->background->white 如图所⽰：

制作b-factor-value 图。

点击A->preset->b-factor putty， 如下图所⽰：

3. 对象的Label操作

3.1 添加label

选择需要Label的对象 | 然后点击对象上的L按钮，根据需要，可以标记残基的名字，原⼦的名字，范德华半径、元素的名字等。

1. L->residue 在α碳原⼦上标记其残基名字和编号 （常⽤）

2. L->residue name 在所有原⼦上标记残基名字 （不常⽤）

3. L->clear 删除该对象上所有的Label。

4. L->element symbol 显⽰对象上所有原⼦的元素名字。

5. L->vdw radius 产看原⼦的范德华半径。

对于蛋⽩醛糖还原酶（PDB ID: 4HBK），我们在UniProt 数据库中查询得到，其⼝袋中的重要残基有： TYR48、LYS77 和 HIS110。

我们对这三个残基展⽰其为stick模式，并掩藏主链，并通过label按钮标注其氨基酸残基的名字。 移动Label，使其更加清晰可见。具体操作流程如下:。

1. 载⼊4hbk 蛋⽩load 4hbk.cif。

2. 在4hbk object 上点击 S->as cartoon。

3. 点击右下⾓的sequence开关按钮，选择 TYR48 LYS77 HIS110 三个残基，得到sele 临时object。

4. 在sele object 上点击 S->stick, H->main chain。

5. 在sele object 上点击 L->residue。

6. 设置背景为⽩⾊，点击菜单栏中 Display->background->white。

7. 点击Mouse Mode 切换为 editing 模式。

8. 按住ctrl键不放，然后将⿏标移动到残基标签上⽅，并按下⿏标左键不放，然后移动⿏标，就可以调整标签的位置。

9. 调整结束后，点击Mouse Mode 切换为 view 模式。

image.png

3.2 移动标签label

以PDB ID: 1w22蛋⽩为例，为其中的锌离⼦添加标签。

sphere模式下不能添加label；借⽤PS中复制图层的概念。为锌离⼦添加label。

step1 选中锌离⼦；

step2 复制锌离⼦；仅仅显⽰该object，并显⽰为lincore模式。

step3 添加label(右击new-pseudoatom-label); 进⼊edit模式，按住ctrl移动label，完成后切换回viewing模式step4 显⽰所有的object.。

image.png

3.3 设置label的样式

3.3.1 调整配体的位置

pymol中包含配体和蛋⽩，那我们如何调整配体和蛋⽩的相对位置。

以PDB ID: 1hkv 为例，其中配体⼩分⼦为PLP。

step1 打开蛋⽩⽂件，定位到想要移动的配体。

step2 extract 操作，提取配体为新的object，并进⾏重命名。

step3 对蛋⽩进⾏固定（最⼤化窗⼝），

step4 在edit模式下，按住shit 就可以通过⿏标移动配体。(只是空间位置的变动，center还是不变的)。

image.png

3.3.2 测量距离

点击菜单栏中的Wizard->Measurement 就可以进⾏距离测量。然后分别选择两个2个原⼦就可以显⽰这2个原⼦的距离。这⾥蓝⾊表⽰N端， 红⾊表⽰O端。

⽐如我们想测定TYR48中侧链上的O原⼦到Lys77侧链N原⼦的距离，如下操作即可：

1. 点击Wizard->Measurement；打开了Measurement ⾯板，位于object list⾯板下⽅；

2. 选好残基Y48和K77，⿏标点击TYR48侧链上的O原⼦ 和 LYS77 侧链上⾯的N原⼦；这⾥为了⽅便，我把cartoon部分和主链部分给隐掉。

了。

3. 如要测定其他2个原⼦的距离，⿏标继续点击选择2个原⼦就可以了；

4. 测定完成后，点击Measurement ⾯板中的done 就可以了。

image.png

3.3.3 突变氨基酸残基

如把4hbk 中的arg-40 突变成 lys-40,。

在菜单中点击wizard->mutagenesis->protein。

image.png

突变前.png

突变后.png

4. 其他技巧

4.1 设置透明度

⿏标操作只能基于显⽰模式进⾏设置，如：cartoon surface sphere stick等。

1. 将cartoon 设置成透明的，透明度50%；点击菜单栏中的Setting->Transparency->cartoon->50%;。

2. 将Surface 设置成透明的，透明度50%；点击菜单栏中的Setting->Transparency->surface->50%;。

3. 将Stick 设置成透明的，透明度50%；点击菜单栏中的Setting->Transparency->stick->50%;。

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【软件使用】PyMol入门教程。

【软件使⽤】PyMol⼊门教程。

主要讲述PyMOL中常见的图形界⾯（⿏标）操作。

1.认识PyMol

1. 软件界⾯介绍

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image.png

1.2 内置demo介绍

打开PyMOL，点击1.1菜单窗⼝的Wizard菜单，然后点击Demo->Representations 然后在2.3 对象窗⼝ 和 2.4模式窗⼝之间会出现各种⽰例：

烟草对染色体变异的影响

1. RP-HPLC法测定巯基含量。

采用色谱柱Kromasil-C18 (250×4.6mm, 5μm)，流动相A(0.1%TFA)和流动相B（甲醇）梯度洗脱：流动相B 40%~80%，0~10min，然后80% B保持5min，流速0.8mL/min，检测波长327nm，得到NTB标准曲线y=3.67059x+0.14123，回收率101.9%，RSD=l.17%，从而建立了一种高灵敏度巯基检测方法。

2. 采用分子荧光光谱法作为反应条件，用反相高效液相色谱梯度洗脱法测定巯基。

用OPA、丹酰氯、茚三酮与半胱氨酸反应，测其可见紫外吸收光谱及荧光光谱；在不同PH、温度、反应时间条件下，用OPA与半胱氨酸反应测其荧光度；分别吸收0.1mmol/L半胱氨酸溶液0、20、40、60、80、100 μl，各加入10 μlH2O2,室温下反应30min，然后加热蒸干，残渣用200μl OPA衍生液，定容至5 ml，4 min时测其荧光光谱。取pH8.4的硼酸缓冲溶液 5μl，混合10次；加入OPA衍生液2μl，混合进样走HPLC。梯度条件：洗脱液B所占比例0min为0，17min线性增加至60%，17.5min线性增加至100%，20min洗脱结束。激发波长为340nm,荧光检测波长为450nm。

3.柱前衍生高效液相色谱-紫外检测法。

以tris(2-carboxylethyl) – phosphine (TCEP)为还原剂，7–fluorbenzo–2–oxa –1,3– diazole– 4-sulfonate(SBD-F)为衍生剂，N-乙酰半胱氨酸为内标，C8色谱柱分离，流动相为甲醇 -磷酸盐缓冲液（pH =3. 0）,梯度洗脱 ,385 nm处检测。线性范围为8. 3～1042. 6 μmol/L,最低检测限为 0. 42μmol/L,日内精密度为 1. 67%～1. 86%,日间精密度为 2. 08%～3. 06 %,平均回收率为 98. 1%～103. 2 %。

4. 电化学脱附与荧光技术联用。

将样品固定在烷基硫醇自组装膜修饰的金电极表面 ,通过荧光试剂马来酰亚胺与游离巯基反应原位标记 GSH,恒电位条件下脱附电极表面吸附物 ,检测脱附物在 0.1 mol·L.KOH溶液中的荧光强度。

植物病毒 特异性受体有谁知道关于植物病毒特异性受体

烟丝对染色体变异的影响

摘 要：以等量清水浸泡不同量的烟丝得到不同浓度浸泡液，用烟丝浸泡液对蚕豆种子进行处理，观察蚕豆根尖细胞染色体是否发生结构畸变，并统计其根尖染色体的畸变情况。结果表明：高浓度的烟丝浸泡液能诱导蚕豆根尖细胞染色体变异效果明显，说明吸烟有害健康。

关键词：蚕豆；烟丝浸泡液；染色体变异。

前言

染色体是生物遗传物质的载体，它的结构、形态、功能是细胞遗传学中的核心内容。任何一个物种的染色体形态、结构和数目是相对稳定的，但绝非永恒不变。在自然条件下，某些环境因素的异常变化往往能引起植物染色体形态、结构和数目的变异[1]。如果用物理、化学因素认为的处理植物，则可以大大提高变异频率。烟丝中含有烟焦油，尼古丁，氯化氢等有毒物质。本实验就是为了观察这些物质是否影响细胞的正常分裂，并引起染色体变异，从而进一步说明吸烟有害健康。

1 材料与方法

1.1 试验材料

当年产的新鲜蚕豆种子

1.2 试验方法[2]

(1) 取 5 只大烧杯，各盛 300 毫升自来水，分别投入 1 支、 2 支、 3 支、4支、5支香烟浸泡数天，制成香烟浸出液。

(2) 将同一品种的蚕豆各 10 粒，浸泡在香烟浸出液中。 24 小时后，将浸泡后的蚕豆种子放在垫有吸水纸的培养皿中培养，温度以 20 ～ 25 ℃为宜，并继续用相应的香烟浸出液使吸水纸保持湿润。

(3) 另取蚕豆 10 粒用自来水浸泡、湿润、在相同温度条件下发芽。以此为对照组。

(4) 发芽约 7 天左右，待根长到 1 ～ 1.5 厘米长时，于上午 9 ： 00 或下午 2 ： 00 左右剪取主根或侧根根尖 3 毫米长。这时细胞分裂比较旺盛。

(5) 剪下根尖立即放入盛有 10% 盐酸的小玻璃皿中，在室温下解离 10 分钟左右，待根尖酥软后，用镊子取出，放入盛有清水的玻璃皿中漂洗 5 ～ 10 分钟。

(6) 用改良苯酚品红染色 5 ～ 10 分钟，或用其它染液，如 1% 醋酸地衣红等染色 5 ～ 10 分钟。用清水洗去浮色后放在载玻片上，加一滴清水，加盖盖玻片，用手指均匀轻压，使细胞分散开来。

(7) 用高倍镜观察并统计细胞分裂后期正常细胞数和异常细胞数。

2 结果与分析

2.1 烟丝浸出液对蚕豆根尖分生组织细胞有丝分裂的影响。

从压片镜检结果看，蚕豆根尖分生组织细胞有丝分裂周期中，由于不同浓度浸出液的处理，使染色体发生了结构变异，出现了一些异常的现象。

首先，镜检结果中正常细胞的结构（图1）所示。其次，在镜检的结果中发现了微核（图2）。微核是真核生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期的一种表现形式。指位于细胞的细胞质中独立于主核，直径是主核的1/20～1/3，完全与主核分开的圆形或椭圆形的微小核[3]。据此统计得出染色体的变异率。

图1 正常的蚕豆根尖细胞染色体。

图2 染色体畸变时产生的微核。

2.2 结果

烟丝浸泡液和对照组清水对蚕豆根尖分生区细胞的作用，显示各组实验数据（表1）中，发现烟丝浸出液对蚕豆染色体畸变有明显的影响，而且随着浓度的增高，染色体的变异率逐渐变大[4]。5支香烟的烟丝浸出液产生的变异率高达了13.0％。

表1 烟丝浸出液对蚕豆根尖分生区细胞的影响。

烟丝液

观察细胞数

正常分裂细胞数

异常分裂细胞数

畸变率

1支烟的烟丝浸出液

200

197

1.5％

2支烟的烟丝浸出液

200

192

4.0％

3支烟的烟丝浸出液

200

187

13

6.5％

4支烟的烟丝浸出液

200

184

16

8.0％

5支烟的烟丝浸出液

200

174

26

13.0％

清水（对照）

200

200

200

0％

2.3 分析

烟草中含有数百种复杂的化学成分，大部分对人体有害，其中焦油、尼古丁、酚类、醇类、酸类、醛类等40种是有毒和有致癌作用的物质。这些物质容易诱发导致细胞染色体变异，产生变异细胞，如果引起体细胞不断增生，也就是平常所说的肿瘤或癌症（恶性)；如果引起生殖细胞（卵细胞或精子）变异，则会影响到下一代[5]。故烟丝浸出液对蚕豆根尖分生区细胞染色体有明显影响，而且随着浸出液浓度的增高，染色体的变异率逐渐变大。本研究为宣传吸烟有害健康提供了科学依据.。

参考文献

[1] 林彤 殴琳.物理新技术在作物诱变育种中的应用进展[J].福建农业科技,2000,4:21-23.。

[2] 李国珍.染色体及其研究方法[M].北京：科学出版社,1985.59.。

[3] 刘祖洞.遗传学(下册)[M].北京:高教出版社,1991.4-16.。

[4] 宋炜 刘志增 陈景堂 等.诱变技术在植物育种中的应用[J].河北农业大学学报,2003,26:116-118.。

[5] Cao Enhua et al. Roe of Lipid peroxidation products in cell mutagenesis induced by photosensitization [ J]. Acta Laser BioLogy sinica, 1998,7 ( 1 ) : 3 - 7.。

Ti质粒的起源是什么啊

1《遗传》2007年01期 卢雅薇;沈文涛;唐清杰;周鹏。

【作者单位】：中国热带农业科学院热带生物技术研究所热带作物生物技术国家重点实验室 海口571101。

【关键词】：植物病毒;外源基因;抗原展示系统;多肽表达系统;病毒载体。

【分类号】：Q943.2

【DOI】：CNKI:ISSN:0253-9772.0.2007-01-006。

2植物病毒介体传播的分子机制 。

文章来源： 2006-7-18 19:05:13 。

植物病毒介体传播的分子机制

中国病毒学 1999年第4期第14卷 评述。

作者：叶 荣 陈剑平 于善谦

单位：叶 荣 于善谦 复旦大学生命学院微生物学系，上海 200433；陈剑平 浙江省农业科学院病毒研究所，杭州 310021。

关键词：植物病毒；介体；传播；分子生物学。

Molecular Mechanism of Transmission of Plant Virus by Vector。

Ye Rong1 Chen Jianping2 Yu Shanqian1。

1 (Department of Microbiology, Fudan University, Shanghai 200433)。

2 (Institute of Virology, Zhejiang Academy of Agricultural Science, Hangzhou 310021)。

Key words Plant virus, Vector, Transmission, Molecular biology。

1 前言

植物病毒47个属中，被证实可通过天然生物媒介传播的病毒有40个属。植物病毒经空气传播(air-borne)的介体是昆虫和螨，而经土壤传播(soil-borne)的介体为线虫和真菌。此外，植物病毒传播还可通过寄主植物的种子(seed-borne)和花粉(pollen-borne)传播。

天然传播介体因其各自的生物学特性不同使其传播植物病毒的方式呈现不同的特点，且与被携带的病毒长期相互作用，形成特殊的传播机理。几十年来介体传播的机理和规律一直是植物病毒学研究的重要课题，并且已经积累了相当多的资料。然而，有关介体传播机理的分子水平的信息相对较少。近年来，随着分子生物学技术的发展，关于植物病毒与传播介体的分子水平的研究报道逐渐增多，现综述如下。

2 昆虫介体(Insect vector)。

2.1 非持续性传播

马铃薯Y病毒属(Potyvirus)在自然界由蚜虫以非持续性方式传播。近年研究发现，两个由病毒编码的蛋白与介体传播有关：一个是外壳蛋白(Coat protein, CP)，另一个为辅助因子(Helper component protease, HC-Pro)〔1〕，见图1。

图1 马铃薯Y病毒属基因组(A)和与蚜虫传播有关的蛋白(B)。

Fig.1 The genome of genus potyvirus (A) and the proteins related to the aphid transmission (B)。

2.1.1 外壳蛋白(CP)。

植物病毒CP与蚜虫传播的关系早就有推测，直至Govier和Kassanis研究烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus, TEV)与马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)的HC的关系时才得到较为明显的证据〔2〕。现已知道PVY CP的N端暴露表面的氨基酸三联子Asp-Ala-Gly (DAG box)保守区对蚜虫传播是必须的，并推测其为HC相互作用的功能区。烟草脉斑驳病毒(Tobacco vein mottling virus, TVMV)〔3〕和西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)〔4〕的CP基因突变分析，进一步明确DAG三联子在蚜虫传播中的作用。在TVMV CP中，这三个氨基酸任何一个缺失或替换，均能导致蚜虫传播特性明显下降或完全丧失。在DAG三联子不同位置的氨基酸能影响蚜虫的传播特性，第一位氨基酸是酸性或中性氨基酸(Asp或Asn)而不是碱性氨基酸有传播性。第二位为一个小的非极性残基(Ala)对传播是必须的，残基变大或极性增强对传播均产生负面的影响。第三位的甘氨酸(Gly)是影响传播的关键，变为任何其它氨基酸，即使是小残基的氨基酸如Ala，均能导致虫传性的丧失〔5〕。虽然Potyvirus CP DAG下游的氨基酸并不表现为高度保守，但TVMV DAG下游的Lys替换为Glu、Arg或Asp时，也能影响蚜虫的传播功能〔6〕。用胰蛋白酶切去TVMV CP N端包括DAG及下游区域的氨基酸，虽然感染的植物蚜虫传播性减弱，但纯化后的病毒其蚜虫传播能力并不受影响。因此DAG下游的近N端的残基除了参与蚜虫传播外，还可能与TVMV的生活周期有关〔5〕。

2.1.2 辅助蛋白(HC-Pro)。

体外实验证明：纯化的TEV病毒粒子只能被那些预先用含有PVY HC因子的汁液饲养过的蚜虫传播，而用健康植物汁液预先饲养的蚜虫，却不能传毒，即使先饲毒而后再获取HC因子也不能传毒〔2〕。从感染的植物中纯化HC组分，结果证明HC为蛋白组分，用部分纯化的来源于TVMV感染的烟草HC组分制备的抗血清，与TVMV基因体外翻译产物进行免疫沉淀，得到75 kDa蛋白〔7〕。这个蛋白相当于TVMV多聚蛋白的N端部分，现已知为P1和HC-Pro部分，如辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus, PMV)体外翻译得到两个较小的蛋白，30 kDa(P1)和51 kDa(HC-Pro)〔8〕。由不同的病毒纯化的HC-Pro的分子量为53 kDa(TVMV)至58 kDa(PVY)，在非变性条件下，有生物活性的HC-Pro蛋白为100至150 kDa，故认为其活性功能单位为均一双亚基结构〔9〕。

将PVY的一个非蚜虫传播的HC缺陷株(称为PVC)与野生的PVY进行比较后发现，非虫传播PVC并不是缺失HC蛋白，因为在PVC感染的植物提取液中也能检测到迁移率与PVY HC相同的蛋白。比较二者HC基因的核苷酸序列有92%一致，仅相差24个核苷酸。进一步比较其相应的氨基酸序列，发现只有2个氨基酸被替换，即Lys50→Glu，Ile225→Val〔10〕，用点突变的方法证明了TVMV HC N端的Lys51→Glu改变，导致了蚜虫传播性的丢失，而与Ile226→Val无关系〔11〕。Lys51被大部分氨基酸替代后均失去虫传活性，但对Arg替代却是允许的。此外，HC N端的His、Cys保守残基的改变，也影响虫传活性，有些甚至导致病毒失活〔12〕。其它一些经人工接种数代后失去传播性的病毒株，如PVY-PTA，ZYMV和PVY-O，也发现在同样的位点(Lys)被其它氨基酸所取代，如PVY-PTA和ZYMV被Glu，PVY-O被Asn取代。在Cys-rich区，Gly→Glu变化也会造成虫传性的丢失〔13〕，这些结构特点说明Lys51残基可能参与对生物活性二聚体形成所必须的离子相互作用；Cys和His保守排列也许有利于形成对虫传作用重要的结构或功能区——类锌指结构〔11〕。在ZYMV HC的C端存在一个保守的Pro-Thr-Lys序列(PTK box)，其中Thr→Ala导致蚜虫传毒活性的完全丧失。在Lys-Ile-Thr-Cys(KITC box)中Lys也与蚜虫传播有关〔14〕。这些位点之间要相互作用，直接或间接地(保持空间构象)参与蚜虫传毒过程的完成。

2.1.3 CP和HC-Pro相互作用。

早在1974年Govier和Kaissanis〔2〕发现HC与蚜虫传播有关，从而就提出一种假说来解释这一现象，即认为HC作为一个双功能分子，一个功能区与病毒CP结合，另一功能区与蚜虫口器类似受体的部分结构。这一假说被称之为成桥学说(Bridge theory)〔15〕。蚜虫在以非持续性方式传播病毒过程中，往往在很短的时间(5～10 s)内完成穿刺表皮和叶肉细胞、分泌唾液、探测和吸食汁液的过程。用电穿刺图象(EPG)技术记录整个过程，可以分为三个不同的时相。只有第二时相为真正的胞内期，此时相又可以分为三个不同的亚时相(Ⅱ-1，Ⅱ-2，Ⅱ-3)。唾液注入伴随病毒的接种发生在Ⅱ-1时相(仅1 s左右)，而吸食汁液伴随着病毒的获得发生在Ⅱ-3时相内(约4 s之内)〔16〕。在如此短的时间内存在于汁液中的HC、病毒粒子(CP)和蚜虫口器上皮细胞受体，便发生快速的识别与结合过程。用透射电镜及免疫胶体金标记，观察发现TVMV和PVY的HC分子在蚜虫口器的下鄂食道表皮及前肠部位聚集并结合，而无单独的病毒粒子〔17〕。另外PVY HC分子能够介导CP上具有完整的DAG结构的TEV粒子在蚜虫口针的顶端1/3处停留，而带突变DAG功能区的粒子则不能停留〔18〕。这些结果均有力地支持了成桥学说，但是关于其相互作用的细微机理仍很少知道，也许HC组分是通过其N-端结构区的PTK box特异性，识别病毒粒子DAG位点或蚜虫口器内的受体。

但是用玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus，MDMV)的CP N端多肽与麦芽糖结合蛋白(Maltose-binding protein, MBP)在E.coli表达的融合蛋白预先饲喂蚜虫，能大大降低其蚜虫传播性〔19〕。最近Blanc等应用蛋白印迹重叠(Protein blotting-overlay)方法分析TVMV的CP和HC的体外特异性结合发现：HC能够与虫传型的TVMV的粒子或单个CP亚基结合，但与非虫传型的不反应。TVMV CP (DAG)的一系列突变子的虫传性与其对HC的结合能力呈高度相关，并确定与HC结合最小的结构域为包括DAG在内的7个氨基酸(DTVDAGK)，位于TVMV CP从N端开始的2～8位的氨基酸〔20〕，所以也不能排除病毒CP直接与蚜虫口器内的受体结合的可能性，也许在病毒感染的植物或蚜虫口器中，在HC蛋白辅助下，病毒CP N端发生折叠，暴露出N端的结构域(如DAG三联子等)，然后再与蚜虫口器内的受体结合。

2.2 持续性传播

经蚜虫以持续性传播方式传播的病毒，主要有黄化病毒属(Luteovirus)的大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)、马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus, PLRV)、甜菜西方黄化病毒(Beet western yellow virus, BWYV)和耳突花叶病毒属(Enamovirus)的豌豆耳突花叶病毒(Pea enation mosaic virus, PEMV)等。BYDV有明显的介体特异性，根据蚜虫传播特异性可分为5个株系：PAV、MAV、RPV、SGV和RMV。Luteovirus在蚜虫体内以非增殖型循环方式存在，蚜虫从寄主韧皮部获得的病毒粒子要穿过蚜虫后肠(Hindgut, HG)上皮细胞进入血腔(Hemocoel)，然后穿过副唾液腺(Accessory salivary gland, ASG)细胞进入唾液管，最后在取食时从唾液分泌而感染新的寄主(见图2)〔21〕。

超微结构研究显示，病毒超过HG和ASG的细胞膜是通过一种受体介导的细胞内吞作用(Receptor-mediated endocytosis)来实现的，但穿越包裹在ASG四周的基底膜(basal lemma)的机制不甚明了。实验显示传播介体这种作为屏障的基底膜对相应的特异性病毒的通透性，明显不同于非特异性病毒，说明不同株系病毒的CP结构域能特异地与不同蚜虫介体基底膜上的相应受体作用〔22〕。Peiffer等将两株纯化病毒BYDV-PAV和-RPV注入五种不同的蚜虫体内发现，两种病毒只特异性吸附至其相应的蚜虫介体ASG基底膜上。病毒粒子对基底膜的穿透能力和对细胞膜是不一样的，体外实验也证明BYDV-MAV只吸附在相应的介体Sitobion avenae的ASG基低膜上，而不与非特异介体Rhopalosiphum maidis的ASG反应。将阴离子铁蛋白和阳离子铁蛋白注入蚜虫体内，只有阳离子铁蛋白聚集在ASG基膜表面及质膜内陷的凹口处，说明这些位点有净负电荷，并且ASG基低膜能限制20 nm以上的大分子通过，也间接说明25 nm直径的BYDV粒子必须具有更高的亲和力，这些结果表明ASG基底膜和质膜含有独自的特异组分参与病毒粒子的识别及转移〔23〕。

BYDV基因组有6个开读框(ORFs)，其中ORF3编码一个22 kDa的CP，下游紧接着的是ORF5，编码一个50 kDa蛋白。如果CP基因的琥珀终止子被抑制，产生通读，形成22 kDa和50 kDa融合成的72 kDa通读蛋白(Readthrough protein, RT)〔24〕，此蛋白在感染的组织中和病毒粒子上均存在。用缺失重组实验证明ORF5对虫传性是必须的，但对蚜虫后肠摄取病毒和释放至血腔无关。ORF4编码的17 kDa蛋白与植物的系统性感染有关。比较6株Luteovirus由ORF5编码的氨基酸序列显示，近CP端的同源性高于C端，认为保守的N端结构区与蚜虫特异性有关〔25〕。三株可被桃蚜(Myzus percicae)传播的Luteovirus(Group Ⅱ)，其RT蛋白C端的氨基酸序列一致〔25〕。而两株在M.percicae传播中有差异的PLPV，其RT蛋白C端也有三个氨基酸的差异〔26〕。此外一个缺失ORF5 BWYV的感染性克隆，能感染植物，但不被蚜虫传播〔27〕。这些结果说明，ORF5编码的50 kDa蛋白N端与蚜虫传播有关，C端与蚜虫特异性有关，这种特异性决定了病毒粒子能否通过蚜虫ASG的基底膜。

1994年Johannes等用蛋白印迹重叠法筛选桃蚜体内可能与PLRV结合的分子，结果发现有5个蚜虫蛋白和PLRV有亲和性，其中最容易检测出来的分子量为63 kDa的共生素(Symbionin)，是蚜虫体内共生细菌合成的主要蛋白，释放至血淋巴液(Haemolymph)中，进一步研究表明PLRV粒子也能与天然共生素结合。用抗生素抑制蚜虫体内原核蛋白的合成，发现PLRV的传播活性下降了70%，病毒的CP也被降解。由此认为内生细菌及分泌的Symbionin对PLRV在蚜虫血腔中的持续性循环起稳定作用〔28〕。近期研究发现这种共生素由细菌Buchnera sp.产生，不同种蚜虫来源的蛋白在结构和功能区的氨基酸序列与E.coli GroEL蛋白相似，故也将其称为Buchrera GroEL。E.coli GroEL是分子伴侣蛋白60(Chaperon 60)家族的成员之一。分子伴侣蛋白是一种ATP依赖性蛋白，能结合稳定新合成的或转移的有聚集倾向的多肽，介导其功能折叠与装配，因而是细胞生存必须的蛋白质。Buchnera GroEL并不限制于细胞质中，在胞外组织蚜虫血淋巴液中浓度很高。BYDV、BWYV和PEMV均能与传毒或不传毒蚜虫来源的GroEL结合，但亲合力不一样，其结合部位位于RT蛋白的N端。GroEL由14个单体构成复合分子，排列成双层环状，与二十面体的病毒粒子结合，从而稳定病毒粒子不被破坏，得以在蚜虫血腔中长期存留，故GroEL似乎与蚜虫的传毒特异无关。

2.3 增殖型持续性传播

番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)由多种蓟马(Thrips)以持续方式传播，并在介体内增殖〔29〕。病毒RNA分别为2.9(S RNA)、4.8(M RNA)和8.9(L RNA) kb。M RNA是双义RNA(Ambisense)，正链编码一个33.6 kDa非结构蛋白(NS m)，互补链编码一个127.4 kDa蛋白，形成糖蛋白G1和G2。从一些实验推测病毒的糖蛋白G1和G2在病毒的感染周期中有双向功能，一是病毒粒子的成熟或组装，二是连接到细胞表面的受体〔31〕，但在病毒复制、致病性及与介体的关系仍不十分清楚。将TSWV重复机械接种寄主，导致M RNA编码糖蛋白的序列丢失而形成衣壳缺陷突变子，这些突变子感染植物寄主的方式与野生型无差异，但却不再被蓟马介体传播，提示糖蛋白可能对病毒的获取是需要的〔32〕。糖蛋白基因克隆于昆虫杆状病毒中也能表达，加工为G1和G2，并在感染的细胞中积累，说明此蛋白不需病毒的其他蛋白存在也能表达〔33〕。

最近Kikkert等〔34〕在蓟马(Frankliniella occidentalis和Thrips tabaci)中发现了一个94 kDa蛋白质，能够与TSWV粒子结合，结合部位为粒子衣壳上G2糖蛋白，此蛋白存在于两种介体的整个发育阶段和除了肠道以外的任何部位。其功能类似于Symbionin。

3 线虫介体(Nematode vector)。

烟草脆裂病毒属(Tobravirus)有三种病毒：烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)、碗豆早褐病毒(Pea early-browning virus, PEBV)和辣椒环斑病毒(Pepper ringspot virus, PRV)。不同血清型的病毒，有其特异的传播介体线虫，如TRV分离株PpK20由Paratrichodous pachdermus传播；而PEBV分离株TpA56由Trichodous primitivus传播。Tobravirus的RNA2除编码CP外，根据其核苷酸大小不一，不同的分离株还有一个或更多的基因编码非结构蛋白。如TRV-PpK20的RNA2还可编码29.4 kDa和32.8 kDa蛋白〔35〕，PEBV-TpA56或SP5的RNA2还可编码9 kDa、29.6 kDa和23 kDa三个蛋白〔36〕(见图3)，但是TRV和PEBV的非结构蛋白间无明显的序列上的相似性。

图3 TRV和PEBV突变株RNA2基因组。

Fig.3 The gene organization of RNA2 of TRV and PEBV isolates。

将线虫传播的TRV分离株PpK20和非线虫传播的TRV分离株PLB的RNA1和RNA2进行不同组合的假重组发现，只有含PpK20 RNA2的病毒能被P.pachydermus传播，从而证明线虫传播性是由RNA2决定的〔37〕。用PLB分离株免疫Balb/c小鼠，获得抗TRV的5株单克隆抗体分别与PLB和PpK20进行ELISA、Western blot、ISEM和Pepscan，并未发现CP抗原结构与线虫传播有明显的关系〔38〕。TRV PpK20 RNA2编码的二个非结构蛋白(29.4 kDa和32.8 kDa)的基因缺失或发生移码突变，并不影响RNA2的复制及装配，但是29.4 kDa基因单独突变或与32.8 kDa基因同时突变时会导致其线虫传播能力的丧失，而单一的32.8 kDa基因缺失并不影响线虫的传播性。因此认为29.4 kDa基因是PpK20分离株的线虫传播的决定性因子〔39〕。

将能够被线虫T.primitivus和T.viruliferous传播的PEBV英国分离株(PEBV-E)SP5，经实验室人工接种烟草(N.clevelandii)保存28年后发现，该病毒及其RNA构建的全长感染性全长cDNA克隆，均不能被T.primitivus传播〔40〕。重新构建一个能被T.primitivus传毒的分离物TpA56的全长cDNA克隆，二者核酸系列分析比较后发现，SP5和TpA56的3 374个核苷酸中仅有11个有差异，而其中只有3个碱基的变化影响病毒基因产物的氨基酸顺序，一个在外壳蛋白，另两个发生在29.6 kDa蛋白的非保守区。由此推测这些改变是导致线虫传播丧失的因素〔48〕。然而，进一步的突变试验则显示，PEBV RNA2几乎所有基因，包括CP，29 kDa、23 kDa和9 kDa蛋白均对线虫传播有影响〔41〕。

4 真菌介体(Fungus vector)。

以真菌为介体经土壤传播的植物病毒有近三十种。以油壶菌(Chytrid)为传毒介体主要是对称球状病毒，如黄瓜坏死病毒(Cucumber necrosis virus, CNV)由黄瓜油壶菌(Olpidium radicale)传播，烟草坏死病毒(Tobacco necrotic virus, TNV)由芸苔油壶菌(Olpidium brassicae)传播。以根肿菌(Plasmodiophorid)的禾谷多粘菌(Polymyxa graminis)、甜菜多粘菌(P.betae)和马铃薯粉痂菌(Spongospora subterraneus)传播的有棒状病毒——真菌传棒状病毒属(Furovirus)、线状病毒——大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)。油壶菌主要通过表面携带病毒，病毒粒子粘附在游动孢子质膜与孢子一同进入植物根部的细胞。而根肿菌作为传播介体时，病毒存在于游动孢子的体内，并认为可能在其原生质中进行增殖。

4.1 外壳蛋白

黄瓜坏死病毒(CNV)的CP亚基按T=3排列。结构类似于X-线晶体结构已测定的番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus, TBSV)，其CP含有三个主要结构域：面向内部的RNA结合区(R)、紧密的包装壳区(S)和面向外部的突出区(P)。R区和S区由一臂(a)联接，S区与P区由一短的铰链(h)联接。CNV的基因为单一正链RNA，与TBSV一样，单个CP的结构区由线状排列的病毒基因顺序编码。早期工作证明，CP与病毒的胞间运动和系统运动无关，但P区对粒子组装及稳定是必须的。

将CNV CP基因与非真菌传播的TBSV的Cherry株互相交换后发现，CNV CP与真菌传播特异性有关〔42〕。用人工接种连续传代获得一个CNV真菌传播缺失突变子LL5，用LL5 CP的基因替代野生型CNV CP基因构建的感染性cDNA克隆，获得的病毒粒子不能由O.radicale传毒。序列分析表明突变子LL5 CP仅在两处发生氨基酸替换，一是a区的Phe→Cys，另一位点为S区Glu→Lys。人工突变证明，只有S区Glu→Lys导致传播性降低。体外结合实验也显示突变子LL5与游动孢子的结合率明显低于野生型，而非真菌传播的TBSV几乎不与游动孢子结构。这些结果提示：CNV由O.radicale传播是通过病毒粒子的(CP)与游动孢子上的受体特异性识别而发生的〔43〕。

4.2 外壳蛋白通读区(CP-RT)。

土传小麦花叶病毒(Soil-borne wheat mosaic virus, SBWMV)，甜菜坏死黄脉病毒(Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV)和马铃薯帚顶病毒(Potato mop-top virus, PMTV)分别由真菌P.graminis、P.betae和S.subterraneus传播。BNYVV有5个基因组。RNA1和RNA2的基因编码产物与病毒RNA复制、组装、细胞间运动及机械接种的叶片感染相关；RNA3和RNA4对真菌P.batae的根部侵染是必须的，RNA5目前仍不完全清楚，可能与甜菜根茎症状发生有关。RNA2共有6个基因，包括一个三基因块(triple gene block, TGB)与细胞间运动有关，近3′端的基因编码一个蛋白(P14)参与RNA复制及表达的调控，靠5′端的ORF表达CP(P21)，此顺反子的终止子为单一琥珀终止子，抑制后形成一个分子量为75 kDa的通读蛋白(Readthrough domain, RTD)〔44〕。SBWMV的RNA2和PMTV的RNA3也有同样的结构〔45，46〕。用免疫金标观察发现BNYVV和PMTV的通读蛋白存在于部分病毒粒子的一端，证明RTD也与装配有关〔47，48〕。

Bymovirus的大麦和性花叶病毒(Barley mild mosaic virus, BaMMV)〔49〕和Furovirus的BNYVV〔50〕、SBWMV〔51〕经多次人工接种后导致病毒失去其真菌传播特性，这些突变子的序列分析发现其RNA2 CP-PT区发生缺失，说明CP-RT区与真菌传播有关。通过筛选得到一系列BNYVV RNA2 CP下游54 kDa RT功能区的连续的缺失突变子(间隔约100 bp左右)，进行功能测定后发现，RT功能区又可分为两个亚功能区组成，近N端一半左右的区域与病毒粒子的装配有关，而C端部分与真菌介体传播有关。用丙氨酸扫描突变(Alanine scanning mutagenesis)方法进一步证明，位于C端的411个核苷酸区域(1417～1827)内有一个KTER功能区，相当于P75蛋白的第553至556个氨基酸，对真菌的传播尤其重要〔52〕。同样在SBWMV RNA2 CP-PT区也有这样一个非常相似区域KTEIR(位于RT蛋白(P84)的第643至647个氨基酸)〔45〕，但在PMTV RNA3中却无此功能区〔46〕。

5 结束语

植物病毒及其介体传播的分子机制的研究，主要集中在病毒参与传播的基因及产物的确定和传播介体内的相当于病毒特异性受体结合蛋白的分析。大部分介体传播的植物病毒经多次的人工接种传代后，会逐渐失去其介体传播特性，从而获得非介体传播的突变体。通过分析比较突变体和野生型病毒基因或基因产物的差异，能够确定改变了的基因位点或产物结构域与介体传播的关系。再用人工点突变的方法逐步缩小目的基因产物的变化位点与介体传播的关系。另一方面从传播介体出发，应用印迹重叠技术，找出传播介体内与病毒有关的蛋白。以上都是目前研究病毒与传播介体关系的较好方法，当然，在研究的方法手段方面还有待改进和发展。

目前关于Potyvirus的CP与HC-Pro的一些氨基酸位点与蚜虫非持续传播的分子间相互作用的机理研究较多，但在非持续传播与半持续传播方式间以及增殖型与非增殖型的循环传播方式间的分子差异所知甚少。虽然有一些病毒，如伤瘤病毒(Wound tumor virus, WTV)能在介体昆虫来源的体细胞中体外培养成功〔53〕，它与昆虫细胞间相互作用的详细分子机理的研究不多。当然，介体对植物病毒的传播作用，有时是相互关联的，如最近发现黄瓜油壶菌(Olpidium bornovanus)的存在，使甜瓜坏死斑点病毒(Melon necrotic spot virus, MNSV)的种子传播性提高〔54〕，线虫传播的病毒常常也可经种子传播，说明植物病毒与其生物介体的相互作用的机理是一个生态适应与进化的过程。实际上除此之外，病毒、传播介体和寄主三者的分子水平的深入研究和揭示，对于弄清病毒的起源与进化，病毒的生态与分子宏观上的控制，都具有重要的理论和实际意义。

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